LC-MS/MSタンパク質全配列検証

現代医薬工業の進歩に伴い、シーケンス分析はタンパク質、ペプチド、抗体、ワクチンなどのバイオ医薬品分子およびコラーゲンなどの医療機器製品の研究開発や品質管理において重要な役割を果たすようになりました。タンパク質の全シーケンス検証分析は重要な役割を担い、組換えタンパク質ペプチド系バイオ製品の完全かつ正確な発現を確認し、製品の品質と有効性を確保します。

バイタイパークバイオテクノロジー（BTP）は、CNAS/ISO9001の二重品質認証システムに基づき、タンパク質シーケンシングプラットフォームを構築しています。このプラットフォームは、N末端シーケンス分析機器、超高性能液体クロマトグラフィー高分解能質量分析連携装置、最適化されたデ・ノボシーケンシングアルゴリズムプラットフォームを備えています。先進的な分析装置とアルゴリズムを組み合わせることで、BTPはタンパク質の全シーケンス検証分析を行い、タンパク質の完全性と正確性を確保し、研究と品質管理のニーズに応えます。

液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS/MS）によるタンパク質全シーケンス検証分析:

タンパク質全シーケンス検証分析の一般的なプロセスは、特異的なプロテアーゼを用いてタンパク質分子を酵素消化し、酵素消化後の試験品は複雑なペプチド混合物となり、その後液体クロマトグラフィー質量分析プラットフォームを用いて試験品を質量分析します。

まず、サンプルを前処理します。つまり、タンパク質の全長理論アミノ酸シーケンスと質量分析レベルのプロテアーゼの切断部位情報を組み合わせ、少なくとも5種類のプロテアーゼを選択してタンパク質を酵素消化し、酵素消化効率を向上させ、より高いカバレッジを得ることを目指します。実際の実験では、さまざまなプロテアーゼ（トリプシン、キモトリプシン、Asp-N、Glu-C、Lys-C、およびLys-Nなど）から適切なプロテアーゼまたは組み合わせた酵素消化方法を選択してターゲットタンパク質を酵素消化します。次に、液体クロマトグラフィー質量分析Nano-LC-MS/MSプラットフォームを使用して酵素消化後のペプチド混合物を分析し、総イオン流クロマトグラムと質量分析の生データを取得します。その後、測定されたタンパク質の理論シーケンスを元にローカルデータベースを作成し、専門の分析ソフトウェアを使用して各酵素消化後に同定されたペプチドを一致させて計算します。酵素消化部位間の相補性を利用してタンパク質シーケンスを組み合わせ、最終的にタンパク質全シーケンスの検証を実現します。

ケース示意図:

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抗体軽鎖全シーケンス検証分析示意図

一般的なプロセス：

1、複数のプロテアーゼを組み合わせて酵素消化を行い、酵素消化効率を向上させ、タンパク質の各アミノ酸のシーケンス情報を得る。

2、Nano-LC-MS/MS液体クロマトグラフィー高分解能プラットフォームを使用してサンプルを分析する。

3、得られた質量電荷比情報を理論シーケンスで構築したデータベースと比較する。

4、各酵素消化方法で同定されたペプチドを組み合わせ、タンパク質が完全かつ正確に発現しているかの情報を得る。

実験機器:

液体クロマトグラフィー装置（Easy-nLC1200）
電気噴霧-四重極型Orbitrap質量分析計（Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ Mass Spectrometer）

応用:

タンパク質、ペプチド、抗体、ワクチン、コラーゲンなどのバイオ製品のアミノ酸全シーケンス検証分析
タンパク質の翻訳後修飾および化学修飾分析
タンパク質、ペプチド、抗体、ワクチン、コラーゲンなどのバイオ製品のアミノ酸シーケンス変異分析

よくある問題:

質問1：カバレッジは何を反映していますか？カバレッジが100%に満たない場合はどう対処すればいいですか？

回答：カバレッジは、シーケンシングされたシーケンスが全シーケンスサイズに占める割合を指します。これは、シーケンシング結果がタンパク質に対するカバー状況を反映しています。カバレッジが100%であれば、サンプルが酵素消化処理された後に得られたシーケンスがターゲットシーケンスと高度に一致していることを示します。カバレッジが100%に満たない場合、タンパク質データとシーケンスをレビューし、欠落しているシーケンスの量や理論上のペプチドが検出されていない部分を確認します。実際の結果に基づいて、既存の方法と酵素消化処理を続けてペプチドの欠落位置を再取得するか、タンパク質サンプル自体に変異があった場合はデ・ノボシーケンシング分析を行う必要があります。

質問2：シーケンシングを行いたいタンパク質の分子量が小さい場合、どのようにタンパク質サンプルを調製すればよいですか？

回答：タンパク質の分子量が小さい場合、高濃度のSDS-PAGEゲルを使用してタンパク質を分離し、コマシーブリリアントブルー染色を行い、目的のタンパク質のサイズに一致するタンパク質バンドを切り取ります。切り取ったタンパク質ゲルストリップを質量分析に使用します。