タンパク質のデ novo シーケンシングと変異分析

タンパク質分子は、試薬キットの開発、診断試薬の開発、薬物開発において重要な役割を果たしています。タンパク質分子自体の一次構造は、その生物学的機能を発揮するための核心であるため、タンパク質の完全な配列を正確かつ迅速に分析することは、未知のタンパク質の機能研究に役立ち、また、モノクローナル抗体などのタンパク質系薬物の開発・製造において非常に重要な意義を持っています。従来のタンパク質配列分析技術は、MALDI-TOF質量分析計に基づくものでも、nanoLC-MS/MSプラットフォームに基づくものでも、タンパク質の識別過程において、識別されるタンパク質を含む配列データベースを利用し、質量分析によって測定された分子量データをデータベースの理論配列を断片化した後に得られる分子量データと比較して、タンパク質のシーケンシングと識別を実現しています。

実際のタンパク質配列分析の過程では、多くのタンパク質の情報が現存のデータベースには含まれていません。例えば、未報告の新しいタンパク質や、新しい生物種から精製されたタンパク質があります。また、多くの場合、理論データの一部を得ることができますが、欠けている部分が重要です。例えば、市場で商業的に改造された酵素の場合、酵素の配列改造情報は逆向きにエンジニアリングを行おうとする競合他社にとって技術的障壁となります。配列の変化は多種多様（点突然変異、欠失、挿入、置換、修飾、融合など）であり、何千もの可能性が存在し、通常、手がかりが全くないのです。試薬キット中の酵素だけでなく、多くのタンパク質薬物も生産量や安定性を向上させるために突然変異によって最適化される必要があります。また、多くの場合、タンパク質配列にいくつかの突然変異が生じます。たとえ薬物中にわずかな配列変異が起こったとしても、生物活性の変化や人体の免疫反応を引き起こし、大きな商業的損失をもたらす可能性があります。上述の未知のタンパク質配列と突然変異の分析の需要から、バイテック社は高分解能質量分析計Obitrap Fusion Lumosを基に、豊富な生物情報学的分析経験を組み合わせ、新しい世代のタンパク質デ・ノボシーケンシングと突然変異分析（De Novo Sequencing）プラットフォームを構築し、タンパク質一次構造の迅速かつ正確な分析を実現しました。

タンパク質デ・ノボシーケンシングと突然変異分析のプロセス

 

タンパク質デ・ノボシーケンシングと突然変異分析のプロセス

 

プラットフォームの利点：

1. タンパク質全配列のカバー（100%配列カバー）
タンパク質の配列決定過程で、5種類の異なるプロテアーゼを選択して酵素消化を行い、異なる酵素消化ペプチド間の相補性を利用してタンパク質分子の100%全配列のつなぎ合わせを実現します。
2. 先進的なデータ処理アルゴリズム
Nature Biotechnologyや専門のプロテオミクス雑誌JPRに発表された文献に基づき、既存の専門的なデータベース非依存のタンパク質配列分析ソフトウェアPEAKS Mass Spectrometry Softwareを組み合わせて、独自の質量分析原データ計算方法を開発し、幅広く狭く出る原則を採用し、有効なデータ情報を見逃すことなく、タンパク質配列の正確な識別を実現しました。
3. 高精度と正確性
シーケンシング過程で、高分解能と高感度を持つOrbitrap Fusion Lumos質量分析計を使用します。旧世代の質量分析計（例えばObitrap Elite、Q Exactiveなど）と比較して、Lumosは一次および二次質量スペクトルのスキャン速度を向上させながら、ペプチド分子量の正確性を保証します。一次質量スペクトルのスキャン速度の向上は、同じペプチドがより多くの回数識別されるのに役立ち、結果の信頼性を高めます。二次質量スペクトルのスキャン速度の向上により、より良い断片化が可能になり（以下の図のように）、結果の正確性を保証し、二次断片の特徴的なピークを通じてロイシンとイソロイシンの正確な識別を可能にします。

 

タンパク質デ・ノボシーケンシングと突然変異分析2

4. 厳格な配列予測と厳密な配列検証
シーケンシングの結果はまず配列予測を行い、さらに測定した配列で新しいデータベースを構築し、Sequence Confirmationのモードを用いて収集された質量スペクトルデータを再度分析します。完全に一致した結果のみを顧客に提供します。

応用分野

1. 学術研究において、研究論文の発表に必要な未知のタンパク質またはペプチドの配列情報を正確に測定します。
2. 商業化改造されたタンパク質と酵素の配列を正確に測定します。多くの商業価値の高いタンパク質（大部分は酵素）は、特定の改造を受けて、天然タンパク質よりも優れた特性を持つ製品となっています。これらの配列の変更されたタンパク質の正確な遺伝子配列またはアミノ酸配列は一般に公開されていないことが多いですが、これらのタンパク質製品は容易に入手可能です。したがって、これらのタンパク質製品の配列を正確に測定することには大きな商業価値があります。
3. 安定した細胞株で発現するタンパク質の配列を正確に測定します。細胞株の構築と保存においてしばしば突然変異（配列差異、sequence variant (SV) とも呼ばれる）が発生し、製品中に含まれるごくわずかなSVでも生物活性の変化や人体の免疫反応を引き起こす可能性があり、大きな潜在的リスクをもたらします。したがって、大規模生産前にこのような天然の突然変異を検出することが重要です。私たちの開発した方法は、1つのアミノ酸の配列差異まで検出でき、検出範囲はタンパク質/抗体全体の配列をカバーします。

中/英語プロジェクトレポート

技術レポートでは、バイテックは詳細な中英二言語版の技術レポートを提供します。レポートには以下が含まれます：

1. 実験手順（中英語）
2. 関連する質量分析パラメータ（中英語）
3. 質量スペクトル画像
4. 原データ
5. ペプチド配列情報
6. タンパク質配列と突然変異情報