エドマン分解に基づくタンパク質N末端配列分析
精製されたタンパク質産物、特にタンパク質製品の分析において、タンパク質の末端を検証する必要があります。これにより、精製された産物のN末端およびC末端の配列が正確であることを保証します。Edman分解法は、タンパク質のN末端配列分析において非常に成熟した方法の1つであり、広く応用されています。バイオテック社は島津製作所のEdmanシーケンシングシステムを採用し、研究者や研究機関に精製されたタンパク質産物、抗体、タンパク質ワクチンのN末端シーケンシングサービスを提供しています。当社のシーケンシングシステムを用いることで、N末端の30個のアミノ酸の配列情報を測定できます。特定のタンパク質サンプルシステムを使用すると、N末端の60～70個のアミノ酸を測定することができます。バイオテック社はまた、先進的なLC-MS/MS技術を用いたN末端シーケンシングプラットフォームを構築し、Edman分解法と補完し合い、閉鎖および修飾されたタンパク質末端を測定することができます。これにより、N末端シーケンシングサービスの円滑な実施が保証されます。
タンパク質シーケンシングの前に、サンプルはまずSDS-PAGEで分離され、サンプルの純度がシーケンシングの要件を満たすことを保証します。その後、SDS-PAGE上のタンパク質サンプルをPVDF膜に転写します。染色でタンパク質バンドを確認して切り出し、得られたPVDF膜上のタンパク質サンプルをEdmanシーケンサーで分析します。Edman分解シーケンシングは、タンパク質のN末端からアミノ酸を1つずつ識別する循環反応を通じて、N末端配列を測定します。各Edmanシーケンシング反応は3つのステップで構成されます。第1ステップでは、アルカリ条件下でPITCがタンパク質のN末端の遊離アミノ基と結合します。第2ステップでは、酸性溶液中でN末端残基が切り取られます。第3ステップでは、PITC結合残基がより安定したPTH残基に変換され、オンラインHPLC分析により、洗脱時間に基づいてアミノ酸の種類を特定します。
• 細胞株の確立および発酵過程でのタンパク質産物の検証：細胞株の確立および発酵過程でのタンパク質産物のN末端メチオニンおよびシグナルペプチドが適切に処理されているかどうかを検証。
• タンパク質分解/酵素切断分析：分解/酵素切断によって形成された新しいタンパク質断片のN末端を分析し、切断/酵素切断部位を特定します。
• De-novoシーケンシング：タンパク質データベースに存在しない新しいタンパク質配列を分析します。
1.サンプルの電気泳動と電気転写
a. タンパク質サンプルの1Dまたは2Dゲル電気泳動
b. ゲル上のサンプルをPVDF膜に転写します。注意：絶対にニトロセルロース膜を使用しないでください。
c. この過程で手袋とヘアネットを着用し、自己のケラチンがシーケンシング結果に影響を与えないようにします。
2.PVDF膜の染色
a. 染色中はコマシーブリリアントブルーまたはリスプリンレッドを使用してPVDF膜を染色できます。注意：絶対に銀染色法を使用しないでください。
b. 染色が完了したら、二重蒸留水でPVDF膜を洗浄します。
c. 転写バッファーにグリシンが含まれている場合、PVDF膜を何度も洗浄し、グリシンが後続の分析に影響を与えないようにします。
d. 詳細なサンプル準備手順については、Edmanシーケンシングサンプル準備プロトコルを参照してください。
3.ターゲットタンパク質バンドの取得
a. PVDF膜を染色した後、ターゲットバンドが明確に見えるので、清潔な解剖用ナイフでターゲットタンパク質バンドを切り取ります。
b. タンパク質量が許容される場合、ターゲットタンパク質の量を増やすために2〜3本のターゲットバンドを準備できます。
4.サンプルの輸送
切り取ったタンパク質バンドを密閉包装し、アイスパックを使用して輸送します。
溶液サンプルの準備過程
1.タンパク質の純度と用量
a. サンプル量は1〜10μg必要です。
b. サンプルの純度は90%以上である必要があります。
c. バッファーには界面活性剤を使用せず、溶液の塩濃度をできるだけ低くしてください。
d. トリス、グリシン、グアニジン、グリセロール、スクロース、エタノールアミン、SDS、トリトンX-100、ツイーンおよび他の界面活性剤、硫酸アンモニウムおよび他のアンモニウム塩は、後続のアミノ酸識別に影響を与えるため、サンプル準備中に使用を避けてください。
e. サンプル準備中は常にマスクとヘアネットを着用し、ケラチンの影響を避けてください。
2.タンパク質サンプルの輸送
a. 液体サンプルはドライアイスでの輸送を推奨します。
b. 液体サンプルは凍結乾燥または真空乾燥後、アイスパックを使用して輸送することも可能です。
1. 実験手順（中英語）
2. 関連する質量分析のパラメータ（中英語）
3. タンパク質N末端シーケンシングの詳細情報
4. 質量分析の画像
5. 生データ
タンパク質シーケンシングの前に、サンプルはまずSDS-PAGEで分離され、サンプルの純度がシーケンシングの要件を満たすことを保証します。その後、SDS-PAGE上のタンパク質サンプルをPVDF膜に転写します。染色でタンパク質バンドを確認して切り出し、得られたPVDF膜上のタンパク質サンプルをEdmanシーケンサーで分析します。Edman分解シーケンシングは、タンパク質のN末端からアミノ酸を1つずつ識別する循環反応を通じて、N末端配列を測定します。各Edmanシーケンシング反応は3つのステップで構成されます。第1ステップでは、アルカリ条件下でPITCがタンパク質のN末端の遊離アミノ基と結合します。第2ステップでは、酸性溶液中でN末端残基が切り取られます。第3ステップでは、PITC結合残基がより安定したPTH残基に変換され、オンラインHPLC分析により、洗脱時間に基づいてアミノ酸の種類を特定します。
Edmanシーケンシング反応過程
Edman分解に基づくタンパク質N末端シーケンシングサービスフロー
Edmanシーケンシング実験フローチャート
応用分野
• タンパク質発現産物の検証：組換えタンパク質の挿入部位および発現順序が正しいかどうか。• 細胞株の確立および発酵過程でのタンパク質産物の検証：細胞株の確立および発酵過程でのタンパク質産物のN末端メチオニンおよびシグナルペプチドが適切に処理されているかどうかを検証。
• タンパク質分解/酵素切断分析：分解/酵素切断によって形成された新しいタンパク質断片のN末端を分析し、切断/酵素切断部位を特定します。
• De-novoシーケンシング：タンパク質データベースに存在しない新しいタンパク質配列を分析します。
サンプルについて
PVDF膜サンプルの準備過程1.サンプルの電気泳動と電気転写
a. タンパク質サンプルの1Dまたは2Dゲル電気泳動
b. ゲル上のサンプルをPVDF膜に転写します。注意：絶対にニトロセルロース膜を使用しないでください。
c. この過程で手袋とヘアネットを着用し、自己のケラチンがシーケンシング結果に影響を与えないようにします。
2.PVDF膜の染色
a. 染色中はコマシーブリリアントブルーまたはリスプリンレッドを使用してPVDF膜を染色できます。注意：絶対に銀染色法を使用しないでください。
b. 染色が完了したら、二重蒸留水でPVDF膜を洗浄します。
c. 転写バッファーにグリシンが含まれている場合、PVDF膜を何度も洗浄し、グリシンが後続の分析に影響を与えないようにします。
d. 詳細なサンプル準備手順については、Edmanシーケンシングサンプル準備プロトコルを参照してください。
3.ターゲットタンパク質バンドの取得
a. PVDF膜を染色した後、ターゲットバンドが明確に見えるので、清潔な解剖用ナイフでターゲットタンパク質バンドを切り取ります。
b. タンパク質量が許容される場合、ターゲットタンパク質の量を増やすために2〜3本のターゲットバンドを準備できます。
4.サンプルの輸送
切り取ったタンパク質バンドを密閉包装し、アイスパックを使用して輸送します。
溶液サンプルの準備過程
1.タンパク質の純度と用量
a. サンプル量は1〜10μg必要です。
b. サンプルの純度は90%以上である必要があります。
c. バッファーには界面活性剤を使用せず、溶液の塩濃度をできるだけ低くしてください。
d. トリス、グリシン、グアニジン、グリセロール、スクロース、エタノールアミン、SDS、トリトンX-100、ツイーンおよび他の界面活性剤、硫酸アンモニウムおよび他のアンモニウム塩は、後続のアミノ酸識別に影響を与えるため、サンプル準備中に使用を避けてください。
e. サンプル準備中は常にマスクとヘアネットを着用し、ケラチンの影響を避けてください。
2.タンパク質サンプルの輸送
a. 液体サンプルはドライアイスでの輸送を推奨します。
b. 液体サンプルは凍結乾燥または真空乾燥後、アイスパックを使用して輸送することも可能です。
研究事例
下図のように、Edmanシーケンシングを通じて、識別されたアミノ酸の詳細情報を提供できます。
Edmanシーケンシング研究事例
中/英語のプロジェクトレポート
技術報告書では、バイオテックは詳細な中英二言語版技術報告書を提供します。報告書には以下が含まれます：1. 実験手順（中英語）
2. 関連する質量分析のパラメータ（中英語）
3. タンパク質N末端シーケンシングの詳細情報
4. 質量分析の画像
5. 生データ
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