小分子薬物標的の同定と検証

現代の医薬品の発見と開発において、薬物ターゲットと作用機序は依然として最大の課題となっています。正しい薬物作用ターゲットは、薬物の効力と特異性に関係するだけでなく、薬物の安全性と潜在的な副作用の問題にも関与しています。薬物ターゲットとは、薬物が体内の生体高分子と直接結合する部位を指し、主に受容体、酵素、イオンチャネル、トランスポーター、核酸などの生体高分子を含みます。薬物作用のターゲットを特定することは新薬設計において極めて重要であり、薬物の作用メカニズムを理解し、薬物の活性と生物学的機能との関係を構築し、可能性のある副作用と耐性メカニズムを予測し、新たな治療ターゲットを発見するのに役立ちます。ターゲットの特定を通じて、薬物開発プロセスの効率性と薬物上市後の安全性を確保できます。

新しい薬物作用ターゲットは、一連の新薬発見の突破口であり、薬物作用の新しいターゲットを見つけることは、今日の革新的な薬物開発の激しい競争の焦点となっています。薬物開発の観点から、薬物の効果はその作用ターゲットに大きく依存します。現在、主に2つの薬物発見戦略が使用されています：表現型に基づく薬物発見とターゲットに基づく薬物発見です。表現型に基づく薬物発見は、既存の薬理学に基づいて、細胞、組織、または器官で小分子またはペプチドをスクリーニングします。ターゲットに基づく薬物発見は、まずターゲットを特定し、次に活性分子を識別します。分子生物学の急速な発展により、ターゲットに基づく薬物発見パラダイムは、スクリーニング能力を向上させ、合理的な薬物発見計画を定義できるため、従来の表現型に基づく方法に取って代わりました。

酵素を薬物ターゲットとする

バイタイパークバイオテクノロジー（BTP）は、高分解能質量分析プラットフォームを活用し、親和性クロマトグラフィ技術と活性部位指向プローブ技術を組み合わせて、ターゲットベースの小分子薬物ターゲット同定プラットフォームを開発および検証し、分子間相互作用の同定全プロセス研究サービスを提供しています。これには、タンパク質-タンパク質相互作用（PPI）、タンパク質-小分子薬物相互作用が含まれ、小分子薬物の作用ターゲットを正確に識別および検証し、革新的な薬物の発見と開発を支援します。バイタイパークバイオテクノロジーのターゲットベースの小分子薬物ターゲット同定プランには次のものが含まれます：

ABPPに基づく戦略の小分子薬物ターゲット同定と検証

活性ベースのタンパク質プロファイリング（Activity-based protein profiling、ABPP）は、活性ベースのプローブとプロテオミクス技術を組み合わせて、小分子のタンパク質ターゲット、さらにはターゲットタンパク質の活性部位を識別するために使用されます。ABPPは、2つの要素で構成される活性部位指向化学プローブを利用しています：1）活性部位指向反応基、触媒関連酵素の特定サブセット（またはファミリー）と結合し、共有結合で標識するため、および2）検出/定量および/または標識された酵素の濃縮/同定に使用されるレポータタグ（例：蛍光団、生物素、アルキン、アジド）。原則として、小分子の活性基は、ターゲットの捕捉を促進するために、ターゲットタンパク質とレポータ基と直接相互作用します。選択したレポータグループに応じて、さまざまな後続実験を行うことができます。たとえば、蛍光団は、細胞または動物中の小分子の迅速なゲルスクリーニングと同定に使用でき、生物素はタンパク質濃縮に使用され、その後、質量分析によってターゲットタンパク質を同定します。

Front Pharmacol. 2018 Apr 9;9:353.

活性ベースのタンパク質分析ワークフロー

サービス内容

技術的な利点

1）特異性：特定の活性プローブを使用して活性酵素を標的的に標識し、高度に特異的に活性タンパク質を識別します。

2）機能解析：タンパク質の酵素活性状態を直接評価することができ、その発現量や構造変化だけでなく、

3）リアルタイムモニタリング：細胞内の生理条件下で酵素の活性を監視し、薬物の即時影響を捉えることができます。

4）非侵襲性標識：プローブとタンパク質の共有結合は非侵襲的であり、その正常な機能を妨げず、生体サンプルの生理的真実性を維持します。

5）サンプル適用性：ABPP技術は、細胞溶解物、活細胞、動物溶解物、さらには生体動物にも使用できます。

2.戦略に基づく小分子薬物ターゲット同定

熱プロテオミクス分析（Proteome-Wide Thermal Stability Profiling）は、小分子化合物とタンパク質の相互作用を包括的に理解することを目的としています。その核心原理は、加熱時にタンパク質が変性し、不溶化するという事実に基づいています。タンパク質は、小分子（例：薬物や代謝物）、核酸、その他のタンパク質との相互作用や翻訳後修飾時にその熱安定性を変えることができます。熱プロテオミクス分析は、多重定量質量分析に基づくプロテオミクスを使用して、数千種類の発現タンパク質の融解曲線を監視します。重要な点は、この方法は、in vitro、in situ、またはin vivoで実施可能です。熱プロテオミクス分析は、薬物のターゲットとオフターゲットの識別、タンパク質-代謝物およびタンパク質-タンパク質相互作用の研究、代謝物結合タンパク質の識別、およびさまざまなヌクレオチドとの相互作用を持つタンパク質のマッピングに成功しています。

Nat Prod Rep. 2016; 33(5):719-730.

熱プロテオミクス分析戦略に基づく小分子薬物ターゲット同定ワークフロー

サービス内容

技術的な利点

1）全体性と非バイアス性：全タンパク質レベルで、小分子とタンパク質の相互作用を偏りなく探索できます。

2）細胞内作用分析：細胞の生理環境中で、実際の薬物-タンパク質相互作用を捉え、薬物の実際の効果を反映します。

3）定量性：薬物-ターゲット相互作用の強度と安定性に関する定量的情報を提供できます。

4）データの信頼性：熱プロテオミクス分析は、複数の温度点で同時に行うことができるため、実験設定によるバイアスを減らし、データの再現性と信頼性を向上させます。

LiP-MS戦略に基づく小分子薬物ターゲット同定

制限的酵素消化-質量分析（Limited Proteolysis-Mass Spectrometry、LiP-MS）は、タンパク質の制限的酵素消化と質量分析を組み合わせた技術で、特定の条件下でプロテアーゼを利用してタンパク質を限られた切断を行い、生成されたタンパク質断片を質量分析で同定します。小分子薬物ターゲットの同定過程では、小分子薬物とその潜在的なタンパク質ターゲットをインキュベートし、薬物分子がタンパク質と結合すると、タンパク質の構造が変化し、この変化がタンパク質の酵素消化パターンに影響を与えます。薬物処理条件と未処理条件でのタンパク質の酵素消化断片を比較することで、薬物と相互作用するタンパク質領域を特定し、薬物の作用ターゲットを推測します。これは、薬物メカニズムの解析や新薬発見に非常に重要な意義を持ち、特に薬物分子の設計や薬物効果の最適化において重要です。

Piazza, et al. 2018, Cell 172, 358-372.

LiP-MS戦略に基づく小分子薬物ターゲット同定ワークフロー

サービス内容

技術的な利点

1）高スループットと高感度：LiP-MSは、数千のタンパク質サンプルを分析でき、低濃度のタンパク質ターゲットであっても同定可能です。

2）事前知識不要：この方法は潜在的なターゲットに関する事前情報を必要とせず、広範なタンパク質中で未知の薬物作用点を発見できます。

3）体外および体内適用性：LiP-MSは体外で行うことも、体内で応用することもでき、薬物がターゲットとどのように相互作用するかに関する情報を提供します。

4）構造動態分析：LiP-MSは、小分子とタンパク質が結合した後のタンパク質構造変化の動的過程を提供できます。

DARTS戦略に基づく小分子薬物ターゲット同定

薬物親和性応答ターゲット安定性（Drug affinity responsive target stability、DARTS）は、小分子の潜在的なタンパク質ターゲットを比較的迅速かつ直接的に識別する方法であり、小分子との相互作用によってターゲットタンパク質にプロテアーゼからの保護を与えることに依存します。DARTSは、興味のある化合物とキャリアコントロールまたは不活性類似体を使用して細胞ライセートの等分試料を処理し、次にプロテアーゼを使用して細胞ライセート中のタンパク質を制限的に消化します。そして、SDS-PAGEを使用してサンプルを分離し、染色して、小分子から保護されたタンパク質バンドを特定します。最後に、質量分析（MS）を使用して各バンドに存在するタンパク質を同定します。この無偏見な方法は、天然物やその他の生物活性小分子の新しいタンパク質ターゲットを特定するのに成功しています。