N末端配列解析
エドマン分解(Edman降解)は、ペール・エドマン(Pehr Edman)によって初めて創始された、ペプチド鎖またはタンパク質のN末端アミノ酸配列を分析する方法です。エドマン分解法の原理は非常に簡単で、アルカリ性条件下で反応し、フェニルイソチオシアネート(Phenylisothiocyanate, PITC)を用いて検査するタンパク質(ペプチド)のN末端アミノ基と反応させて、フェニルアミノチオカルボニル(PTC)の誘導体を生成します。その後、処理-環化-選択的にペプチド鎖のN末端を切断し、N末端アミノ酸残基のチアゾリノンフェニルアミン誘導体を得ます。次に、有機溶剤を用いて誘導体を抽出し、酸の作用で、不安定な誘導体が安定したフェニルチオヒダントイン(PTH)誘導体に変わり、残りのペプチド鎖のアミド結合は影響を受けません。生成されたフェニルチオヒダントインアミノ酸(PTH-アミノ酸)をHPLCまたは電気泳動法で分析することにより、アミノ酸の種類を特定できます。アミノ酸の識別反応を繰り返すことで、N末端からC末端の方向に沿ってアミノ酸配列の分析を行うことができます。長い配列のタンパク質(ペプチド)に対しては、サンプルを小さなペプチド断片に切断し、まずペプチド断片の配列を分析し、次にペプチド断片情報を組み合わせて完全なタンパク質の配列情報を得ることができます。
タンパク質N末端のシーケンシングプロセス
エドマン分解法を用いたN末端シーケンシングの利点:
1. PITCはすべてのアミノ酸残基との反応生成率と回収率が高いため、副産物が少なく、正確なクロマトグラフィーによる識別が可能です;
2. 反応時間が速く、ほとんどのアミノ酸残基に対して、30分の結合時間と5分の切断反応時間で十分です;
3. 反応後のペプチド鎖は完全であり、新たなN末端アミノ酸をエドマン分解法で繰り返し測定することができます。
エドマン分解法を用いたN末端シーケンシングにおいて注意すべき点:
1. サンプルの純度は90%以上である必要があり、塩イオンの含量は50 mmol/L以内で、SDSなどの変性剤を含まず、N末端は均一で高純度のサンプルでなければなりません;
2. 10 Pmolのサンプルで20個のアミノ酸を測定できます;
3. 液体サンプルにはプロテアーゼを含まないようにし、できるだけ早くテストすることをお勧めします。長時間放置すると分解されやすくなります;
4. 転写膜サンプルは、転写膜前に長時間放置しないようにし、サンプルが拡散しないようにし、転写膜後は密封して保存し、3-6ヶ月間保存できます。Coomassie R-250で染色することをお勧めし、電気泳動バッファーはCAPSバッファーを使用することをお勧めします;
5. サンプルに信号ピークがない場合は、タンパク質のN末端を閉じることをお勧めします;
6. 反応全体で可能な限り高純度のバッファーを使用することをお勧めします。
ケーススタディ:
バイテック・パーク・バイオテクノロジーは、島津製作所のPPSQシリーズの機器を用いて、タンパク質またはペプチドサンプルのN末端アミノ酸配列を分析し、N末端の30個以上のアミノ酸を分析することができます。以下は、あるタンパク質薬物の分析結果の実際のクロマトグラフィーです。このプロジェクトでは、サンプル中のタンパク質薬物の最初の15個のアミノ酸を分析しました。下図(第15アミノ酸のクロマトグラフィー)からもわかるように、クロマトグラフィーのピーク値は非常に高く、非常に正確な結果を得ることができます。
中/英語プロジェクトレポート
技術レポートでは、バイテック・パークは詳細な中英バイリンガル版の技術レポートを提供します。レポートには以下が含まれます:
1. 実験手順(中英語)
2. 関連する質量分析パラメータ(中英語)
3. 質量分析画像
4. 元データ
5. 生物薬物N末端配列情報
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