トランスクリプトームサンプル抽出の手順は何ですか？

トランスクリプトームサンプル抽出の核心は、高品質な総RNAの抽出と品質管理にあります。全ての工程でRNAの分解を避け、可能な限り元の転写物の発現情報を保持する必要があります。以下は標準化された手順です。

 

一、サンプル準備

• サンプルタイプ：細胞、組織、新鮮または凍結保存サンプルが可能で、液体窒素で急速凍結し、−80°CまたはRNA保護液に保存することが推奨されます。

• 注意事項：RNA分解酵素（RNase）の汚染を全工程で避け、DEPC処理された器具と試薬を使用してください。

 

二、RNA抽出

一般的な方法：

• TRIzol法（フェノール/クロロホルム法）：大半の組織サンプルに適し、抽出効率が高いです。

• カラム式試薬キット（例えば、Qiagen RNeasy）：操作が簡単で、高スループットサンプルの処理に適しており、純度が高いですが、産出量はやや少なめです。

手順概略：

1、細胞/組織の破砕：TRIzolまたは破砕液を加え、十分にホモジナイズします。

2、相分離：クロロホルムを加え、遠心分離し層を分け、水層を取ります。

3、RNA沈殿：イソプロパノールを加え、遠心してRNAを回収します。

4、洗浄と再懸濁：70–75%エタノールで洗浄後、RNAを核酸分解酵素のない水で再懸濁します。

5、（オプション）gDNA汚染の除去：DNase I処理（推奨、必須）。

 

三、RNA品質管理

1、濃度測定：NanoDropまたはQubitで行い、A260/280 ≈ 2.0、A260/230 ≥ 1.8を要求します。

2、完全性評価：Agilent Bioanalyzer または TapeStationを使用してRIN値（RNA完全性番号）を測定します。

• RIN ≥ 7.0：トランスクリプトームライブラリー構築に適しています。

• 3'末端のシーケンスのみを目的とする場合、RIN ≥ 5でも許容されます。

• サンプルが著しく分解されている場合、polyA濃縮ではなくrRNA除去法を検討することができます。

 

四、保存

• 短期（<1週間）：−80°C；

• 長期：RNA安定液（例えば、Ambion RNAstable）を加えるか、凍結乾燥保存を推奨します。

 

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