タンパク質免疫ブロッティングおよび電気移動サービス

電気泳動で分離されたタンパク質をゲルから膜（通常はニトロセルロースまたはPVDF）に転写し、その膜上で抗体を用いて検出する技術をタンパク質免疫ブロット（ウェスタンブロットまたはイムノブロッティング）と呼びます。百泰派克バイオテクノロジーはタンパク質免疫ブロット分析サービスを提供しており、この技術は高い選択性と高感度の抗体-抗原相互作用により、複雑なタンパク質混合物から特定のターゲットタンパク質を検出することが可能です。得られたデータは、ターゲットタンパク質の定性および半定量分析に使用できます。

電気転写の一般的なフロー図

タンパク質免疫ブロットは、組織ホモジネートや抽出物サンプル中の特定のタンパク質を検出するための広く使用されているタンパク質分析技術です。タンパク質免疫ブロット法では、ゲル電気泳動を用いて天然タンパク質および変性タンパク質をそれぞれ3次元構造とポリペプチド鎖の長さに基づいて分離し、その後膜（通常はニトロセルロース膜またはPVDF膜）に転写します。最後に、膜上でターゲットタンパク質に対する特異的抗体を用いて特異的に認識します。ウェスタンブロットは分子生物学、生化学、免疫遺伝学およびその他の分子生物学分野で広く利用されています。

タンパク質免疫ブロット分析では、まずさまざまな方法を利用してSDS-PAGEとIEFを使用し、等電点（pI）、分子量、電荷またはこれらの要素の組み合わせを基にゲル電気泳動からサンプル中のタンパク質を分離します。すべてのタンパク質がゲル内で溶解し、同じ方向に移動するため、一般的にSDS-PAGEが使用されます。SDSによる変性作用により、抗原エピトープがより認識されやすくなります。

ゲル電気泳動分析の後、タンパク質をゲルからニトロセルロースまたはポリビニリデンフルオライド（PVDF）膜に転写し、抗体検出に使用します。PVDF膜はタンパク質の結合能力がニトロセルロース膜より高いですが、小さなタンパク質にはニトロセルロース膜がより適しています。タンパク質の主要な転写方法は電気ブロットで、電流を使用してタンパク質をゲルからPVDFまたはニトロセルロース膜に移動させます。電気泳動転写方法には、ウェット転写、セミドライ転写およびセミウェット転写があります。タンパク質分離に等電点フォーカシングを使用する場合、圧力転写拡散を利用してタンパク質を転写する方が効果的です。

転写プロセスは1時間（セミドライ転写）からオーバーナイト転写（ウェット転写）まで様々です。転写が完了すると、膜の自由結合部位はタンパク質混合物でブロックされるため、その後の抗体検出に影響を与えません。転写されたタンパク質を膜上で抗体検出することができます。膜に含まれるタンパク質はまず一次抗体とインキュベートされ、その後一次抗体を認識する二次抗体が結合して検出されます。二次抗体は一般的に報告基団を持ち、高い感度を有します。

最も感度の高い検出方法は、増強化学発光（ECL）を使用する方法です：抗体-ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合物による一次抗体の認識を行います。増強化学発光の特別なバリアントを使用することで、1 pgまでのタンパク質バンドを検出することが可能です。

タンパク質免疫ブロットはまた、タンパク質のリン酸化を追跡することができます。リン酸化タンパク質のすべてのサブタイプに結合する抗体は、二次元ゲル上で「数珠状」の外観を示します。また、免疫共沈で生成された複合体中の既知タンパク質および未知タンパク質を識別するためにも使用できます。ゲル中にターゲットタンパク質が存在する限り、コマッシーブルー染色を使用してゲルから対応するスポットを切り出し、質量分析による後続の同定を行うことができます。