クロスリンク法によるタンパク質相互作用分析

生理条件下、ほとんどのタンパク質間相互作用の持続時間は非常に短いため、相互作用の研究が困難です。架橋試薬はこの問題に対する解決策を提供し、タンパク質相互作用時にそれらを共有結合で架橋し、タンパク質-タンパク質複合体を捕捉し、短い弱い相互作用を凍結することで、短期間の相互作用タンパク質の分離と特性評価を実現します。架橋プロセスは体内または体外で行うことができ、使用する場所はプロジェクトの要求に応じて異なります。両者の違いは、体内架橋ではタンパク質が天然状態で架橋されるのに対し、体外架橋ではタンパク質が変性する可能性があることです。

インビボ架橋
インビボ架橋反応では、タンパク質架橋反応が細胞内で行われるため、偽陽性の相互作用やタンパク質複合体の安定性喪失のリスクを排除できます。細胞膜内のタンパク質は通常、疎水性および脂溶性の架橋剤を用いて架橋反応を行い、細胞膜上に位置するタンパク質（血漿に固定された受容体など）は通常、親水性および水溶性の架橋剤を使用して架橋反応を行います。タンパク質が天然状態を保つにもかかわらず、細胞中のタンパク質の複雑さから、インビボ架橋の最適化プロセスは非常に複雑になる可能性があります。また、非特異的な架橋反応が発生する可能性があり、短い間隔腕の架橋剤を使用することで非特異的な架橋の問題を取り除くことができます。

インビトロ架橋
インビトロ架橋プロセスでは、細胞が均質化され、破壊されます。そのため、この方法はより安定したタンパク質-タンパク質相互作用の分析に適しています。特定の破壊緩衝液中で細胞を破壊するため、反応条件の制御が比較的容易になり、温度、pH、イオン強度などの反応条件を調整できます。体内環境の制約を受けないため、選択可能な架橋剤の種類が増え、非特異的な架橋の制御がより容易になります。

Dülsner, E. et al. Nat Methods. 2009. 

架橋法によるタンパク質相互作用分析

 

一般的な架橋タイプ

化学架橋
化学架橋剤は、相互作用するタンパク質、ドメイン、またはペプチドを、相互作用により近接する特定のアミノ酸官能基間に化学結合を形成することで共有結合で結合します。プロジェクトの具体的な要求に応じて、多くの商業化された化学架橋剤が選択可能で、同種二官能性または異種二官能性架橋剤、長腕または短腕架橋剤、可逆性または不可逆性架橋剤、水溶性または非水溶性架橋剤などがあります。同種二官能性分子はタンパク質の同じ官能基を対象とし、異種二官能性架橋剤は異なるタンパク質の異なる官能基を対象とすることができ、より大きなバリエーション性や特異的な架橋を実現できます。架橋剤分子も、エステルやジスルフィド結合などの可逆性元素を含むように設計することができ、ヒドロキシルアミンや還元剤を添加することで接続を逆転または破壊できます。疎水性の架橋剤は、疎水性タンパク質ドメインに侵入したり、細胞膜を通過したりすることができます。親水性の架橋剤は、水性環境に架橋を制限することができます。

光感受性架橋
細胞懸濁液または細胞破壊物に架橋剤を添加することで多くの非特異的な架橋形成が生じる可能性があるため、タンパク質-タンパク質相互作用のより良い分析のために、光感受性基団を追加するなどして、より複雑な架橋剤が設計されました。これらの光感受性基団は選択された時間内にのみ反応し、紫外線照射にのみ応答します。異種二官能性架橋剤は、一端に化学架橋基団を持ち、他端に光感受性基団を持ち、選択されたターゲットタンパク質との二段階反応を行うことができます。

架橋法によるタンパク質相互作用分析の特徴

• インビボでの瞬間的なタンパク質間相互作用の分析が可能
• 低親和性のインビトロタンパク質間相互作用の分析が可能
• 高い検出感度

架橋法によるタンパク質相互作用分析の一般的なワークフロー

1. 特定のプロジェクトの要求に応じて架橋法と架橋剤のタイプを設計します：インビボ/インビトロ；
2. 反応条件の最適化：サンプル特性とプロジェクトの要求に応じて、実験条件を最適化します；
3. 細胞破壊、CoIP；
4. タンパク質免疫ブロット/質量分析（プロジェクトの要求に応じて）；
5. データ分析と報告書の提出。

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