タグベースのタンパク質定量技術-iTRAQ、TMT、SILAC
細胞内のプロテオームの豊度の動的変化は、さまざまな生命プロセスに重要な影響を与えます。例えば、多くの疾患の発生と進展は、特定のタンパク質の異常な発現を伴うことが一般的です。定量プロテオミクスは、ゲノム内で発現されるすべてのタンパク質または複雑な混合系におけるすべてのタンパク質を正確に定量し、同定することを目的としています。現在、定量プロテオミクス技術は主にラベル戦略とノンラベル戦略に分かれており、ラベル戦略はインビボラベル（例：SILAC）とインビトロラベル（例：iTRAQ、TMT）に分かれています。
iTRAQの作業フロー
iTRAQ技術の一般的なプロセスは以下の図に示されています。簡単に言うと、サンプルはトリプシンで分解され、アルキル化され、酵素消化されてペプチドにします。iTRAQ試薬のラベルタグを使用して生成されたペプチドを差異ラベルし、ラベルされたサンプルを混合してLC-MS/MS分析を行います。
iTRAQの利点
1. iTRAQは一度の実験で4〜8個のサンプルを同時にラベル付けできます。操作は簡単で迅速です。複数のサンプルの高スループット検出に適しており、実験設計がより柔軟です。
2. iTRAQはペプチドレベルでのインビトロラベルを行い、多くの種類の生物サンプルに適しています。
3. iTRAQは再現性が良く、感度が高く、定性と定量を同時に行うことができます。
TMTの作業フロー
TMTの一般的なプロセスは以下の図に示されています。異なるタンパク質サンプルを変性、還元、アルキル化し、ペプチドサンプルに消化します。そして、これらのペプチドサンプルをTMT試薬でラベル付けし、1つのサンプルにまとめます。HPRP液相クロマトグラフィーでまとめたサンプルを分離し、分画を12個のサンプルとして連鎖します。純化後、HPLC-MSで各サンプルを分析します。分析データからタンパク質の定性および相対定量情報を取得します。
TMTの利点
1. 高感度：低豊度のタンパク質を検出できます。
2. 分離能力が強い：酸性/塩基性タンパク質、小さな10KD未満のタンパク質や200KD以上のタンパク質、不溶性タンパク質などを分離できます。
3. 幅広い応用範囲：膜タンパク質、核タンパク質、細胞外タンパク質など、あらゆる種類のタンパク質を同定できます。
4. 高スループット：10個のサンプルを同時に分析でき、多様な処理方法や処理時間を採用したサンプルの差異タンパク質分析に特に適しています。
SILACの作業フロー
SILACの一般的なプロセスは以下の図に示されています。軽量、中量、または重量の安定同位体でラベル付けされた必須アミノ酸（主にリジンとアルギニン）を細胞培養基に追加し、細胞の通常の代謝を通じて、新しく合成されたすべてのタンパク質に安定同位体がラベル付けされます。すべてのタイプのタンパク質を等量混合し、SDS-PAGEで分離、ゲル切断、酵素消化後、LC-MS/MS分析を行い、関連するタンパク質の定量および定性結果を得ることができます。
SILACの利点
1. SILACは生細胞レベルでのラベル技術です。ラベル効果は安定しており、ラベル効率は溶解液の影響を受けません。
2. SILACでは必要なサンプルが少なく、通常、各サンプルは数十マイクログラムのタンパク質で十分です。
3. SILACは質量分析法を使用して、複数のタンパク質を同時に同定および定量します。
4. SILACはインビボラベル技術を使用しており、サンプルの実際の状態に近いです。
参考文献
1. Zieske Lynn R. A perspective on the use of iTRAQ reagent technology for protein complex and profiling studies. Journal of Experimental Botany, 2006, 57(7):1501-1508.
2. Lichao Zhang, Joshua E. Elias. Relative Protein Quantification Using Tandem Mass Tag Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology, 2017, 1550:185.
3. Esthelle Hoedt, Guoan Zhang, Thomas A. Neubert. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture (SILAC) for Quantitative Proteomics. Adv Exp Med Biol. 2014, 806:93-106.
相対定量および絶対定量等圧ラベル（iTRAQ）
iTRAQは、AB SCIEX社が2004年に開発した定量プロテオミクス研究技術です。この技術により、多くの異なるサンプル中のタンパク質を比較することができます。例えば、異なる病理条件や発達段階における組織サンプルのタンパク質発現レベルの違いを研究することができます。同時に、iTRAQはゲノム内で発現されるすべてのタンパク質または複雑な混合系におけるすべてのタンパク質を正確に定量し、同定することができます。iTRAQは8種類の異なる同位体試薬を使用して、8種類の異なるタンパク質サンプルを同時にラベル付けし比較することができます。ラベル試薬は、報告基、バランス基、およびアミン特異的反応基で構成されています。iTRAQの作業フロー
iTRAQ技術の一般的なプロセスは以下の図に示されています。簡単に言うと、サンプルはトリプシンで分解され、アルキル化され、酵素消化されてペプチドにします。iTRAQ試薬のラベルタグを使用して生成されたペプチドを差異ラベルし、ラベルされたサンプルを混合してLC-MS/MS分析を行います。
4つの異なるサンプル（S1-S4）の多重反応の一般的なスキーム、4つの異なる色で表示（Zieske et al.,2006）
iTRAQの利点
1. iTRAQは一度の実験で4〜8個のサンプルを同時にラベル付けできます。操作は簡単で迅速です。複数のサンプルの高スループット検出に適しており、実験設計がより柔軟です。
2. iTRAQはペプチドレベルでのインビトロラベルを行い、多くの種類の生物サンプルに適しています。
3. iTRAQは再現性が良く、感度が高く、定性と定量を同時に行うことができます。
タンデムマスラベル（TMT）
TMTは、米国Thermo Fisher Scientificが開発したペプチドのインビトロラベル技術です。この技術では、最大10個の同位体ラベルを使用してペプチドのアミンをラベル付けできます。LC-MS/MS分析を経て、10個の異なるサンプル中のタンパク質の相対量を同時に比較することができます。TMTは、疾患バイオマーカーのスクリーニング、薬物作用ターゲット、動植物の抗病性や耐性機構、発育と分化機構などの分野で広く使用されています。TMTの作業フロー
TMTの一般的なプロセスは以下の図に示されています。異なるタンパク質サンプルを変性、還元、アルキル化し、ペプチドサンプルに消化します。そして、これらのペプチドサンプルをTMT試薬でラベル付けし、1つのサンプルにまとめます。HPRP液相クロマトグラフィーでまとめたサンプルを分離し、分画を12個のサンプルとして連鎖します。純化後、HPLC-MSで各サンプルを分析します。分析データからタンパク質の定性および相対定量情報を取得します。
10plex TMTを使用した相対定量のフロー（Zhang et al.,2017）
TMTの利点
1. 高感度：低豊度のタンパク質を検出できます。
2. 分離能力が強い：酸性/塩基性タンパク質、小さな10KD未満のタンパク質や200KD以上のタンパク質、不溶性タンパク質などを分離できます。
3. 幅広い応用範囲：膜タンパク質、核タンパク質、細胞外タンパク質など、あらゆる種類のタンパク質を同定できます。
4. 高スループット：10個のサンプルを同時に分析でき、多様な処理方法や処理時間を採用したサンプルの差異タンパク質分析に特に適しています。
細胞培養中のアミノ酸の安定同位体ラベル（SILAC）
SILACは、高スループット定量プロテオミクスの効果的なアプローチであり、必須アミノ酸に依存した哺乳動物細胞の増殖に基づいて設計されています。SILACは定量プロテオミクス研究に使用され、細胞内のタンパク質相互作用とタンパク質発現の差異を分析し、複雑な哺乳動物細胞プロテオミクスの包括的な定性および定量分析に効果的なソリューションを提供します。SILACの作業フロー
SILACの一般的なプロセスは以下の図に示されています。軽量、中量、または重量の安定同位体でラベル付けされた必須アミノ酸（主にリジンとアルギニン）を細胞培養基に追加し、細胞の通常の代謝を通じて、新しく合成されたすべてのタンパク質に安定同位体がラベル付けされます。すべてのタイプのタンパク質を等量混合し、SDS-PAGEで分離、ゲル切断、酵素消化後、LC-MS/MS分析を行い、関連するタンパク質の定量および定性結果を得ることができます。
SILACを使用したタンパク質定量（Esthelle et al.,2019）
SILACの利点
1. SILACは生細胞レベルでのラベル技術です。ラベル効果は安定しており、ラベル効率は溶解液の影響を受けません。
2. SILACでは必要なサンプルが少なく、通常、各サンプルは数十マイクログラムのタンパク質で十分です。
3. SILACは質量分析法を使用して、複数のタンパク質を同時に同定および定量します。
4. SILACはインビボラベル技術を使用しており、サンプルの実際の状態に近いです。
参考文献
1. Zieske Lynn R. A perspective on the use of iTRAQ reagent technology for protein complex and profiling studies. Journal of Experimental Botany, 2006, 57(7):1501-1508.
2. Lichao Zhang, Joshua E. Elias. Relative Protein Quantification Using Tandem Mass Tag Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology, 2017, 1550:185.
3. Esthelle Hoedt, Guoan Zhang, Thomas A. Neubert. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture (SILAC) for Quantitative Proteomics. Adv Exp Med Biol. 2014, 806:93-106.
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